大家好，感谢邀请，今天来为大家分享一下月季霜霉病病原菌研究：发生特点、分离鉴定及其对植物的损害分析的问题，以及和的一些困惑，大家要是还不太明白的话，也没有关系，因为接下来将为大家分享，希望可以帮助到大家，解决大家的问题，下面就开始吧！
月季为世界四大切花之一，也是云南省切花产量最大的种，近年来，月季设施栽培种植面积稳步递增，霜霉病是月季在设施栽培条件下的毁灭性真菌病害。
该病害具有发病潜伏期长、传播速度快、发病严重、危害大的特点，月季一旦感染此病后，叶片会大量脱落，形成光杆，严重影响了月季的生长势、产量和质量。
与其它病害相比，月季霜霉病早期症状不明显，等发现时，早已错过了最佳防控时期，对月季生产危害极大，很大程度上阻碍了月季产业的发展。
中国最早于 1996 年在沈阳地区附近的一处花圃中发现月季霜霉病，之后全国各个地区均有发现，由于月季霜霉病是霜霉属病原真菌所引起的活体营养型真菌病害。
无法在人工培养基上培养，因此很难按照柯赫氏法则进行离体培养对病原菌进行培养鉴定，因此有关霜霉病的研究报道较少。
目前有学者对甘肃华亭、兰州、河南南阳等地的月季霜霉病进行过观测，并提出了相应的防治措施。
也有学者利用显微和热成像方法对霜霉病菌感染和传播过程进行观测，然而霜霉病菌发生的环境条件、侵染方式和过程均未明晰。
本研究通过采集设施栽培条件下的感病植株作为病原，与健康植株共培养，摸索月季霜霉病的环境条件和发生特点，并通过形态、显微观测及分子手段对新发病的植株上的霜霉病菌进行观测与鉴定，为该病害的防治提供了研究基础。
病原菌显微鉴定形态特征
取月季品种‘梦魅’带有典型霜霉病病叶，于光学显微镜下进行镜检(40X)，观察病原菌的形态特征。
可以观察到霜霉病菌在叶面的几种形态，一开始月季霜霉病病原孢囊梗从气孔中伸出，长成一个笔直主干，主干上开始分为二叉。
然后开始不断二叉式分枝，分枝较为对称，在孢子囊的分枝到分叉间分布着小孢子，呈卵圆形至圆形，直径在 22 μm 左右，小孢子的外层有一层 2 μm 左右的薄壁。
分别取病叶 DNA、孢子悬浮液、病原菌为模板，以引物 ITS1/4 和 PS1/3 进行扩增，得到 PCR 产物，取 5 μL PCR 产物进行 1%琼脂糖电泳检测，在用 ITS 序列进行扩增时病叶 DNA 和病原菌样品均出现两个明亮的条带。
分别在 750~1 000 bp 的位置和 500~750 bp 的位置，在引物 PS1/3 扩增反应中，病叶 DNA 和病原菌均在 750 bp 左右的位置有一条明亮的条带。
说明从病叶上刮蹭下来的病原物是可用于分子鉴定的，而使用 ITS序列扩增的序列可能范围太大，综合扩增条带情况，初步确定使用特异性引物 PS1/3 扩增出来的样品序列为月季霜霉病的序列。
将上述 PCR 扩增产物测序所得的序列在 NCBI 中利用 BLAST 进行同源性比对，其中利用 PS1/3 引物扩增的序列。
全部比对到霜霉属上，近似率最高达到 99.84%，与已报道的霜霉菌寄主为月季的两个序列聚在同一分支上。
综合病原菌的显微形态特征及分子生物学鉴定可以确定培养的月季霜霉病病原物为霜霉属下的种。
在整个培养的过程中发现月季霜霉病菌侵染月季叶片后，月季叶片会表现出多样的病症：叶片褪绿，出现大块黄色。
叶表面出现紫黑色小斑点分布在叶片上，斑点大小不均匀，形状从点到块状，叶面不均匀褪绿，导致叶表面颜色分布不均，有点或块状深绿色呈现在叶表面，叶片有时会出现轻微反卷。
还会在叶片上出现大面积黑色斑块，有似被火灼烧的痕迹，在叶背面有时也会见到一层稀疏的孢子层，除了容易受到侵染的叶片，花梗等新嫩部位也容易受到侵染。
‘弗洛伊德’受霜霉侵染后的形态学变化
根据抗感水平分别采集霜霉病侵染后出现症状的 D1、D3、D6、D9、D12 高感品种月季‘弗洛伊德’病叶，对其叶片的形态进行对比观察。
出现症状的第 1 天，叶正面有轻微褪绿现象，出现浅浅一层紫红色病斑，在第 3 天时，叶片正面的褪绿现象更加明显，病斑颜色加深，D9 时。
病斑已经基本上扩散到整个叶片，叶背面可见紫红色斑点和稀疏孢子层，侵染后期，叶片正反面都可见明显的紫红色斑点充满叶脉。
纵观整个霜霉病菌的发病过程，霜霉病菌的侵染充分展现出极高的“潜伏性”，叶片病斑不是很明显，但在发病第 3 天叶柄处就会形成离层，表现出“一触即落”的特性。
根据抗感水平采集高感品种月季‘弗洛伊德’病叶，从显微水平观察月季霜霉病在叶片上侵染的过程，使用台盼蓝对月季霜霉病的侵染过程进行染色。
染色结果显示，在叶片出现症状的第 1~3 天，叶片上部分未观察到有月季霜霉病菌，D6 时在叶上部可观察到有孢子梗从气孔处萌发，随后霜霉病菌不断扩散延伸，到 D12 可观察到基本充满整个视野。
从叶片上、中、下这三部分来看，叶片中部的病原菌数量和病原菌萌发程度总是高于其他部分，推测月季霜霉病菌的侵染可能是从叶中部开始，叶片中部更容易受到霜霉病菌侵染。
月季霜霉病是世界性的月季真菌病害，对世界月季切花产业的发展产生了重大的影响。其致病菌具有专性寄生的特点，无法直接运用柯赫氏法则，将病原菌在培养基上进行培养纯化鉴定。
在前期对霜霉菌进行培养时，也采用了叶盘法进行培养，但由于在田间采集的霜霉病叶，可能存在同期潜伏着其它病菌。
在用叶盘法培养的后期就会出现叶片腐烂而变成灰霉，且叶片长出孢子的条件也十分严苛，同一批实验中能长出孢子的叶片仅占 5%左右，产孢量少，在保存时间上也存在保存周期短，14 d 之后离体叶片会丧失生理活性。
因此本研究通过调控环境条件，给予霜霉病菌侵染易发的条件活体培养霜霉病菌，发现在湿度达到 70%左右的环境下，叶背面会稳定产孢。
传统病原物的鉴定是以其形态特征作为依据进行判断，对植物受到侵染的表观形态进行观察并结合解剖和显微结构等，选取有代表性的形态特征作为鉴定的依据。
传统形态学鉴定能够直观的鉴定出真菌的类别，对于具有明显特征的真菌病原物是一种快速简便的鉴定方法，但是在近似种之间进行再分类可能存在一定的困难。
病原菌的分子鉴定
本研究在对霜霉病菌进行显微鉴定时，确实能够观察到霜霉的病原物结构，但是在查阅霜霉镜检图时发现与霜霉科好几个病原物的形态特征几乎相同，无法再做出进一步的区分，因此需要借助分子生物学的鉴定技术。
病原菌 rDNA-ITS序列区域已被广泛地应用于病原的鉴定，已开发出 4 条通用引物，其中 ITS1/4 被广泛用于真菌病原的鉴定。
但是在用 ITS1/4 序列对霜霉病菌进行扩增发现会比对上其它真菌，甚至是其它物种的序列。
本研究针对病原菌活体寄生的特性，通过调控霜霉病发生侵染的适宜条件活体培养霜霉病菌，通过对叶片进行脱色再染色方式进行显微鉴定。
再对病叶组织进行 DNA 提取，采用 ITS1/4 和 PS1/3对病叶组织 DNA、孢子悬浮液、病原物进行 PCR 扩增，对培养的霜霉病菌从形态学和分子水平进行鉴定，从而确定了病原菌的种类，初步了解了霜霉病菌在月季上的侵染发生特征。
从云南省晋宁区花卉推广中心采集带有霜霉病的月季品种‘梦魅’的感病植株，取典型霜霉病叶放入卡诺氏固定液(冰醋酸:甲醇=1:3)中，4 ℃下浸泡至叶片褪色，呈现透明状。
褪色完成后将碎片放入 0.4%台盼蓝染色剂中至叶片染色均匀，取出病叶放入蒸馏水中漂洗 2~3 次，放置在蒸馏水中备用(防止病叶失水变干)。
取病叶置于载玻片上，盖上盖玻片，用铅笔头轻轻敲击，使病叶碎片平整展开于光学显微镜下进行镜检，观察病原菌的形态特征。
将采集回来的‘梦魅’带有明显典型症状的霜霉病病叶叶片，用无菌手术剪将叶片明显患病部位剪下，置于称量纸上，称取 100 mg 放于事先预冷的研钵中。
加入适量液氮于研钵中并不断研磨，直至病叶碎片研磨充分，呈现粉末状，用事先预冷好的药匙转移至 1.5 mL 的 EP 离心管中，用 Hipure 真菌 DNA 迷你试剂盒进行 DNA 提取。
对病原物真菌的核糖体内转录间隔区(ITS)进行扩增来对病原物进行鉴定分析，选用真菌通用引物ITS1/ITS4 以及特异性引物 PS1/PS3对月季霜霉病叶 DNA、病原菌(枪头剐蹭少许菌丝)、孢子悬浮液进行 PCR 扩增。
分别以病叶 DNA、病原菌(枪头剐蹭少许菌丝)、孢子悬浮液为模板进行 PCR 扩增，扩增体系 20 μL：2×Taq PCR MasterMix 10 μL，正、反向引物各 1.0 μL，病叶 DNA 模板/孢子悬浮液/病原菌 2 μL/2 μL/枪头尖部少许。
待反应完成后，进行 1%琼脂凝胶电泳 30 min 后在紫外灯下观测条带并进行条带分析并拍照记录。
将 PCR 扩增产物进行测序，测序结果采用 seqman 软件进行正反碱基比对，并进行拼接。将获得的 ITS 序列在 NCBI 网站上进行序列比对。
下载与之相似率高的相关序列，记录寄主物种和相似率，利用 MEGA11.0 中 NJ 法构建系统进化树，自展值 1 000 次。
在研究月季砧木霜霉病的检测时采用 ITS 序列对霜霉病原物 DNA 进行扩增后发现会扩增出月季本身的 DNA 片段，导致序列比对结果比对上月季的序列。
本研究在比对使用 ITS 引物扩增得到的序列时也发现，扩增产物中存在其他物种(月季, 白粉菌, 芋头污斑病)的序列，对实验结果产生了很大影响。
无论是提取的病原物 DNA 还是病原本身扩增出来的序列比对结果都保持高度一致，表明对霜霉这一类专性寄生，不易提取的真菌，使用特异性引物进行分子鉴定更为可行。
植物病害的防治工作是一个复杂的工程，通过精准的鉴定，提出有效的防治措施，这个过程中包括对病害的田间调查和鉴定、病原菌的分离纯化鉴定、病原菌的发生和流行、抗病育种以及各种防治技术的应用。
用户评论
这游戏的背景设定挺特别的，关于一种疾病的研究？我本来以为是动作冒险类的！
有6位网友表示赞同！
感觉这种游戏需要很高的知识储备才能玩好，估计我是打不过的。
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月季霜霉病病原菌？听起来有点吓人啊！
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如果能加入一些解谜元素就好了，太死板了。
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植物伤害？这游戏一定很残酷！
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这种题材的的游戏应该不多见吧？挺有特色的！
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希望能加入一些有趣的画面特效，让枯燥的科研更生动化。
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我觉得这个游戏比较适合学习农学或者生物学的玩家。
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希望游戏能够普及农业知识！
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这种题材的游戏太 niche 了吧？估计很多人不感兴趣。
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玩一款解剖病原菌的游戏，感觉有点恶心啊...
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如果能加入一些互动元素，比如培养菌样本之类的，会更有趣。
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这款游戏看起来非常学术严谨！
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不知道游戏里面有没有隐藏任务？
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这种游戏应该适合喜欢研究的玩家。
有16位网友表示赞同！
希望游戏的故事背景能够更加丰富有趣！
有6位网友表示赞同！
如果能加入一些PVP元素，那就更有意思了！
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感觉这款游戏的难度系数挺高啊...
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期待这游戏的后续更新，希望能加入更多内容！
有10位网友表示赞同！
这种题材的游戏很独特，很有潜力！
有17位网友表示赞同！